US11559807

System and method for precision detection of biomarkers
バイオマーカーの高精度検出のためのシステム及び方法

BACKGROUND
Detection, identification and quantification of biomarkers, such as proteins, peptides, exosomes, hormones, neurotransmitters, metabolites and nucleic acids, are critical to disease diagnosis and progression monitoring. Various approaches have been developed, but the most well-established strategy is to use antibodies. An antibody can recognize and bind to a biomarker (antigen) specifically, and the binding event is then converted into a readable optical, electronic, mechanical, or magnetic signal. A well-known device is lateral flow immunoassay using paper-based strips. These strips are based on visualization of human eyes, which are limited for non-quantitative applications, and insensitive for many clinical needs. To detect low concentration biomarkers, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) has been developed, which amplifies antibody-biomarker binding via enzymatic reactions and converts reaction products into an optical signal (e.g., color changes). Although ELISA is the most established and powerful technique used in clinical and research labs, its limit of detection (LOD) and time required for testing are often insufficient for many clinical applications. The test time referred here in this disclosure is the time duration from the introduction of the sample into the system to reporting of the test results by the apparatus.
Recent technological advances have made it possible to detect single molecules, which have been used to measure the binding of a single biomarker molecule to a capture antibody with improved LOD and shorten test time. This single-molecule approach is referred to as digital immunoassay, one example is digital ELISA. To date, three platforms have been proposed to achieve digital immunoassay. They all rely on the antibody or antigen binding to a biomarker molecule but differ in the platform used to detect the biomarker-antibody or antigen binding events.
The first platform is to replace the large reaction well in the traditional ELISA with an array of microwells. The volume of the microwells is small, such that each microwell has either no biomarker present or a single biomarker molecule that binds to capture antibody conjugated with a magnetic bead in the microwell. In the former case, no enzymatic reaction takes place, and fluorescence readout from the microwell is null (or background level). In the latter case, however, the enzymatic reaction products lead to fluorescence emission, which is detected as a binding event.
The second digital immunoassay platform combines single molecule fluorescent detection with flow cytometry. A sample solution containing a biomarker is incubated with a capture antibody attached either to a plate or a bead. This will allow the binding of the biomarker to the capture antibody. After the incubation, a buffer solution is introduced to wash away unbound biomarkers. A second (detection) antibody conjugated to an alexa fluor tag is then added to the sample for further incubation, followed by second washing. A neutralization buffer is added to break the detection antibody-biomarker complex from plate or bead, which flows through a narrow capillary crossing a laser beam to emit a fluorescent signal detected with a photodetector.
The third platform uses metal nanoparticles (e.g., gold) as a signal readout mechanism. The nanoparticles bind to the biomarkers captured on a sensor surface and detected individually via dark field, interference and plasmonic optical imaging techniques. Using gold nanorods (GNRs) it has been shown that the polarization of the GNRs provides additional information that help detection of molecular binding.
These digital immunoassay technologies provide single molecule detection capability, which significantly improves the LOD of the traditional ELISA. However, the improvement is often achieved at the expense of test time. Another more important remaining drawback of these digital immunoassay technologies is the lack of precision. Fast and precise detection are crucial for disease diagnosis and treatment.
An important example is cardiovascular diseases, where timely and precise assessment of the patient condition is often a matter of life or death. A well-established biomarker in cardiovascular disease is troponin(s), which is a complex of three regulatory proteins including troponin C (TnC), troponin I (TnI) and troponin T (TnT). The troponin complex (e.g., Troponin T) concentration in human blood varies over an extremely broad range, from as low as a few ng/L in healthy population to as high as 104 ng/L in patients with cardiovascular disease. This requires a detection technology not only with sufficient low LOD but also with wide dynamic range. In the case of cardiovascular diseases, monitoring troponin level of a patient with a time interval of 10-20 mins or shorter is highly desired for the doctor to diagnose the condition, assess the disease progression and evaluate the outcome of medication. This requires a fast and precise detection technology. High precision is needed because the change in the troponin level of the patient can be rather small, and thus difficult to resolve with conventional detection technologies. The current technologies fall into two categories. One category is precise but slow. The other one is fast but imprecise. There is a need of both fast and precise detection technology for timely assessment of biomarker level, such as troponin. The detection technology must also have low LOD and wide dynamic range because of the wide distribution of biomarker levels for different people.
The method and system disclosed herein aims to address this unmet need.

【背景技術】
タンパク質、ペプチド、エキソソーム、ホルモン、神経伝達物質、代謝産物、及び核酸などのバイオマーカーの検出、同定、及び定量化は、疾患の診断及び進行モニタリングにおいて極めて重要である。様々なアプローチが開発されているが、最も確立された戦略は抗体を使用することである。抗体は、バイオマーカー（抗原）を特異的に認識してそれに結合することができ、その後、結合イベントが読み取り可能な光学的、電子的、機械的、又は磁気的信号に変換される。よく知られている手法は、紙ベースのストリップを使用するラテラルフローイムノアッセイである。このストリップは肉眼での目視を前提としており、非定量的な用途に限られ、多くの臨床ニーズに対して感度が不十分である。低濃度のバイオマーカーを検出するためにＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）が開発されている。これは、酵素反応を介して抗体－バイオマーカー結合反応を増幅し、反応生成物を光学的信号（例えば、色変化）に変換するものである。ＥＬＩＳＡは、臨床及び研究機関で使用される最も確立された強力な技術であるが、その検出限界（ＬＯＤ）及び試験にかかる時間は、多くの臨床用途に対して十分なものではないことが多い。本開示で言及される試験時間とは、システムへの試料の導入から装置による試験結果の報告までの所要時間である。
近年の技術的進歩は単一分子の検出を可能にし、単一バイオマーカー分子の捕捉抗体への結合を測定するために使用されており、ＬＯＤが改善し試験時間が短縮した。この単一分子アプローチはデジタルイムノアッセイと呼ばれ、一例はデジタルＥＬＩＳＡである。現在までに、デジタルイムノアッセイを実現するために３つのプラットフォームが提案されている。それらはいずれもバイオマーカー分子に対する抗体又は抗原結合に依存するものであるが、バイオマーカー－抗体又は抗原結合イベントを検出するのに使用される基盤技術が異なる。第１のプラットフォームは、従来のＥＬＩＳＡの大きな反応ウェルをマイクロウェルのアレイに置き換えたものである。マイクロウェルの容積は小さいため、各マイクロウェルにはバイオマーカーが存在しないか、又はマイクロウェル内の磁気ビーズとコンジュゲートされた捕捉抗体に結合する単一バイオマーカー分子が存在するかのいずれかとなる。前者の場合は酵素反応が起こらず、マイクロウェルからの蛍光読み取り値はゼロ（又はバックグラウンドレベル）である。反対に後者の場合は酵素反応生成物が蛍光を発し、これが結合イベントとして検出される。
第２のデジタルイムノアッセイプラットフォームでは、単一分子蛍光検出とフローサイトメトリーとが組み合わせられている。バイオマーカーを含有する試料溶液を、プレート又はビーズのいずれかに付着させた捕捉抗体とインキュベートする。これにより、バイオマーカーを捕捉抗体に結合させることができる。インキュベーション後、緩衝液を導入して未結合のバイオマーカーを洗い流す。次に、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒタグにコンジュゲートさせた第２の（検出）抗体を試料に添加して更にインキュベーションし、２回目の洗浄を行う。中和緩衝液を添加して、検出抗体－バイオマーカー複合体をプレート又はビーズから解離させる。この複合体が、レーザービームと交差する狭いキャピラリーを流れ、光検出器で検出される蛍光信号を発する。
第３のプラットフォームでは、信号読み取り機構として金属ナノ粒子（例えば、金）を使用する。センサ表面上に捕捉されたバイオマーカーにナノ粒子を結合させ、暗視野、干渉、及びプラズモン光学イメージング技術によって個々に検出する。金ナノロッド（ＧＮＲ）を使用すると、ＧＮＲの偏光によって分子結合の検出に役立つ付加的な情報が得られることが示されている。これらのデジタルイムノアッセイ技術では単一分子の検出能力が提供され、従来のＥＬＩＳＡのＬＯＤを大幅に改善する。しかしながら、この改善は試験時間の延長と引き換えに達成されることが多い。これらのデジタルイムノアッセイ技術のもう１つのより重要な欠点は、精度の不十分さである。迅速かつ高精度な検出は、疾患の診断及び治療にとって極めて重要である。重要な例は心血管疾患であり、患者の状態を適時にかつ高精度に評価できるかが生死に関わる場合が多い。心血管疾患における確立されたバイオマーカーはトロポニンである。トロポニンは、トロポニンＣ（ＴｎＣ）、トロポニンＩ（ＴｎＩ）、及びトロポニンＴ（ＴｎＴ）を含む３つの制御タンパク質の複合体である。ヒト血液中のトロポニン複合体（例えば、トロポニンＴ）の濃度は、健康集団での数ｎｇ／Ｌという低濃度から心血管疾患患者での１０＾４ｎｇ／Ｌという高濃度までの極めて広い範囲にわたって異なる。これにより、ＬＯＤが十分に低いだけでなくダイナミックレンジが広い検出技術が必要とされる。心血管疾患の場合、医師が状態を診断し、疾患の進行を評価し、投薬の結果を評価するためには、１０～２０分またはそれよりも短い時間間隔で患者のトロポニンレベルをモニタリングすることが極めて望ましい。これには、迅速かつ高精度な検出技術が必要とされる。高い精度が必要とされるのは、患者のトロポニンレベルの変化がかなり小さい場合があるため従来の検出技術では差の識別が困難になり得るためである。現在の技術は２つのカテゴリーに分類される。一方は精度が高いが遅く、もう一方は速いが精度が低い。トロポニンなどのバイオマーカーのレベルを適時に評価するためには、迅速かつ高精度な検出技術が必要である。また、個人間でのバイオマーカーレベルのばらつきが大きいため、検出技術のＬＯＤは低くダイナミックレンジは広くなければならない。
本明細書に開示される方法及びシステムは、この満たされていないニーズに対処することを目的とする。

What is claimed is:
1. A system for quantitative detection of a biomarker in a fluid, comprising:
a fluidic microchannel;
a sensor surface on which a first antibody is attached that can bind specifically with the biomarker;
a delivery device for introducing a fluidic sample containing the biomarker to the sensor surface along the microchannel and allowing the biomarker to be bound to the first antibody;
an illumination source positioned to illuminate the sensor surface;
an optical imaging system configured to capture light scattered by individual binding events of the biomarker to the first antibody on the sensor surface, and configured to generate sequential frames of images of at least a portion of the sensor surface including at least two zones;
an image processing unit, coupled to receive data transmitted from the optical imaging system, being configured to quantify the individual binding events on the sensor surface at the at least two zones, being configured to determine a difference in numbers of binding events on multiple zones of the at least two zones, and being configured to evaluate relative statistical error in the difference in numbers of binding events obtained by comparison of different frames of images of the sequential frames of images to determine sufficiency of a detection time; and
a data calibration system that correlates the difference in the number of binding events on any two zones to the concentration of the biomarker.

2. The system of claim 1, containing the fluidic sample introduced through the delivery device, wherein the fluidic sample is pre-mixed with nanoparticles coated with a second antibody, which conjugate with the biomarker and the first antibody on the sensor surface.

3. The system of claim 2, wherein the optical imaging system forms an image of the nanoparticles on the sensor surface, the image processing unit is configured to quantify the number of the nanoparticles on the sensor surface over the at least two zones in real time, and the image processing unit is configured to determine the difference in the numbers of the nanoparticles on a first zone and a second zone of the at least two zones, and the data calibration system is configured to correlate the difference in the numbers of nanoparticles on the first zone and the second zone to the concentration of the biomarker.

4. The system of claim 1, wherein the delivery device introduces nanoparticles coated with a second antibody to the fluidic microchannel, following introducing the fluidic sample containing the biomarker so as to conjugate with the biomarker captured by the first antibody on the sensor surface.

5. The system of claim 4, wherein the optical imaging system forms an image of the nanoparticles on the sensor surface;
the image processing unit is configured to quantify the number of the nanoparticles on the sensor surface for the at least two zones in real time, and is configured to determine a difference in the numbers of the nanoparticles on a first zone and a second zone of the at least two zones; and
the data calibration system is configured to correlate the difference in the number of nanoparticles on the first zone and the second zone to the concentration of the biomarker.

【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体中のバイオマーカーの定量検出のためのシステムであって、
流体マイクロチャネルと、
前記バイオマーカーと特異的に結合することができる第１の抗体が付着したセンサ表面と、
前記バイオマーカーを含有する流体試料を前記マイクロチャネルに沿って前記センサ表面に導入し、前記バイオマーカーを前記第１の抗体に結合させることを可能にするための送達デバイスと、
前記センサ表面を照明するように位置決めされた照明源と、
前記センサ表面上の前記第１の抗体への前記バイオマーカーの個々の結合イベントによって散乱された光を捕捉するように構成されかつ少なくとも２つのゾーンを含む前記センサ表面の少なくとも一部分の連続フレームの画像を生成するように構成された光学イメージングシステムと、
前記光学イメージングシステムから送信されたデータを受信するように接続され、前記センサ表面上の前記少なくとも２つのゾーンでの前記個々の結合イベントを定量化するように構成され、前記少なくとも２つのゾーンのうちの複数のゾーン上の結合イベントの数の差を決定するように構成され、かつ前記連続フレームの画像の異なるフレームの画像の比較によって得られた前記結合イベントの数の差における相対統計誤差を評価して検出時間の十分性を決定するように構成された画像処理ユニットと、
任意の２つのゾーン上の前記結合イベントの数の差を前記バイオマーカーの濃度に相関させるデータキャリブレーションシステムと、
を備える、システム。

【請求項２】
前記送達デバイスを介して導入された前記流体試料を含有し、前記流体試料が、第２の抗体でコーティングされたナノ粒子と予め混合されており、前記第２の抗体でコーティングされたナノ粒子が、前記バイオマーカー及び前記センサ表面上の前記第１の抗体とコンジュゲートする、請求項１に記載のシステム。

【請求項３】
前記光学イメージングシステムが、前記センサ表面上の前記ナノ粒子の画像を形成し、前記画像処理ユニットが、前記センサ表面上の前記少なくとも２つのゾーンにわたる前記ナノ粒子の数をリアルタイムで定量化するように構成され、かつ前記画像処理ユニットが、前記少なくとも２つのゾーンのうちの第１のゾーン及び第２のゾーン上の前記ナノ粒子の数の差を決定するように構成され、前記データキャリブレーションシステムが、前記第１のゾーン及び前記第２のゾーン上の前記ナノ粒子の数の差を前記バイオマーカーの濃度に相関させるように構成されている、請求項２に記載のシステム。

【請求項４】
前記送達デバイスが、前記バイオマーカーを含有する前記流体試料を導入した後に、前記センサ表面上の前記第１の抗体によって捕捉された前記バイオマーカーとコンジュゲートさせるために第２の抗体でコーティングされたナノ粒子を前記流体マイクロチャネルに導入する、請求項１に記載のシステム。

【請求項５】
前記光学イメージングシステムが、前記センサ表面上の前記ナノ粒子の画像を形成し、
前記画像処理ユニットが、前記少なくとも２つのゾーンについて前記センサ表面上の前記ナノ粒子の数をリアルタイムで定量化するように構成され、かつ前記少なくとも２つのゾーンのうちの第１のゾーン及び第２のゾーン上の前記ナノ粒子の数の差を決定するように構成され、
前記データキャリブレーションシステムが、前記第１のゾーン及び前記第２のゾーン上の前記ナノ粒子の数の差を前記バイオマーカーの濃度に相関させるように構成されている、
請求項４に記載のシステム。